วันนี้เรามาพูดถึงปัญหาที่ทำให้เพื่อนร่วมงานวิจัยนับไม่ถ้วนปวดหัว - การทดลอง Western Blot (WB) สิ่งนี้ดูเหมือนง่าย แต่เต็มไปด้วยการทดลอง "กับดัก" ทำไมมันทำให้เราสะดุดซ้ำแล้วซ้ำอีก? ตอนนี้เรามาตรวจสอบเหตุผลของความล้มเหลวด้วยกัน
I. ไม่มีวงดนตรี
เหตุผลที่เป็นไปได้อาจรวมถึง:
- ปัญหาแอนติบอดี: แอนติบอดีอาจไม่ได้ผล, ไม่เฉพาะเจาะจงหรือไม่ผูกพันกับโปรตีนเป้าหมาย
- ปัญหาตัวอย่าง: ตัวอย่างอาจมีสารรบกวนอยู่ในระดับต่ำเกินไปหรือลดลงแล้ว
- ปัญหา Electrophoresis: เงื่อนไขอิเล็กโทรโฟเรซิสที่ไม่เหมาะสมเช่นแรงดันไฟฟ้าเวลาหรือการใช้บัฟเฟอร์ที่ไม่เหมาะสม
- ปัญหาการถ่ายโอน: ปัญหาในระหว่างกระบวนการถ่ายโอนเช่นการเลือกเมมเบรนที่ไม่เหมาะสมเวลาถ่ายโอนหรือบัฟเฟอร์การถ่ายโอน
- ปัญหาการบล็อก: โซลูชันการบล็อกอาจไม่เหมาะสมหรือเวลาในการปิดกั้นอาจยาวเกินไป
- ปัญหาการย้อมสี: รีเอเจนต์การย้อมสีอาจหมดอายุไม่รู้สึกหรือใช้งานไม่ถูกต้อง
ปัญหาอุปกรณ์: อุปกรณ์อาจทำงานผิดปกติหรือไม่ได้ทำการสอบเทียบอย่างเหมาะสม
- ปัญหาการดำเนินการทดลอง: การดำเนินการทดลองอาจไม่ได้มาตรฐานเช่นการซักไม่เพียงพอหรือการโหลดตัวอย่างที่ไม่สม่ำเสมอ
- ปัญหาการปรับเปลี่ยนโปรตีน: โปรตีนเป้าหมายอาจได้รับการปรับเปลี่ยนหลังการแปลที่ป้องกันการรับรู้แอนติบอดี
- ปัญหาการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมาย: โปรตีนเป้าหมายอาจมีการแสดงออกที่ต่ำมากหรือไม่มีการแสดงออกในเซลล์หรือเนื้อเยื่อที่ถูกตรวจพบ
ii. พื้นหลังสูง
เหตุผลที่เป็นไปได้อาจรวมถึง:
- ความเข้มข้นของแอนติบอดีสูง: การใช้แอนติบอดีมากเกินไปอาจเพิ่มการผูกมัดแบบไม่เจาะจงทำให้เกิดพื้นหลังสูง
- ปัญหาคุณภาพแอนติบอดี: แอนติบอดีอาจมีการผูกมัดที่ไม่เจาะจงสูงหรือมีปฏิกิริยาข้ามกับโปรตีนอื่น ๆ
- การปิดกั้นไม่เพียงพอ: โซลูชันการปิดกั้นไม่สามารถครอบคลุมไซต์ที่มีผลผูกพันที่ไม่เจาะจงได้อย่างมีประสิทธิภาพบนเมมเบรนส่งผลให้พื้นหลังสูง
- ปัญหาเมมเบรน: เมมเบรนอาจมีคุณภาพหรือการปนเปื้อนที่ไม่ดีซึ่งนำไปสู่พื้นหลังที่สูง
- การถ่ายโอนที่ไม่สมบูรณ์: ในระหว่างกระบวนการถ่ายโอนโปรตีนอาจไม่ถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรนอย่างสมบูรณ์ทำให้เกิดพื้นหลังสูง
- การซักไม่เพียงพอ: ขั้นตอนการซักไม่สามารถกำจัดแอนติบอดีที่ไม่ได้ผูกไว้หรือสิ่งสกปรกอื่น ๆ ได้อย่างมีประสิทธิภาพซึ่งนำไปสู่พื้นหลังที่สูง
- ปัญหาการย้อมสีรีเอเจนต์: รีเอเจนต์การย้อมสีอาจมีความอ่อนไหวหรือไม่เสถียรทำให้เกิดพื้นหลังสูง
- ปัญหาอุปกรณ์ทดลอง: อุปกรณ์อาจมีการรั่วไหลหรือรบกวนนำไปสู่พื้นหลังสูง
- ปัญหาตัวอย่างโปรตีน: ตัวอย่างอาจมีสารรบกวนจำนวนมากเช่นผลิตภัณฑ์การย่อยสลายโปรตีนหรือสิ่งสกปรกอื่น ๆ
- ปัญหาการดำเนินการทดลอง: การดำเนินการทดลองอาจไม่ได้มาตรฐานเช่นเวลาฟักตัวเป็นเวลานานหรืออุณหภูมิสูง
สาม. แถบที่ไม่เฉพาะเจาะจงหรือขนาดแถบโปรตีนที่ไม่ถูกต้อง
เหตุผลที่เป็นไปได้อาจรวมถึง:
- ทางเดินของเซลล์มากเกินไปส่งผลให้ระดับการแสดงออกของโปรตีนที่แตกต่างกันนำไปสู่ขนาดแถบที่ไม่สอดคล้องกันหรือมีหลายแถบ
- การย่อยสลายตัวอย่างโปรตีนส่งผลให้น้ำหนักโมเลกุลโปรตีนลดลงหรือมีหลายแถบ
- ในวิฟแสดงตัวอย่างโปรตีนอาจมีการดัดแปลงรูปแบบต่าง ๆ เช่น acetylation, methylation, alkylation, phosphorylation และ glycosylation นำไปสู่ขนาดแถบที่ไม่สอดคล้องกันหรือการปรากฏตัวของหลายแถบ
- โปรตีนเป้าหมายมีหลายไอโซฟอร์มหรือตัวแปรประกบกันส่งผลให้ขนาดแถบที่ไม่สอดคล้องกันหรือการปรากฏตัวของหลายแถบ
